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    详细内容

    蛋白质质谱鉴定

    Label-Free

    非标定量(Label-free)

    非标定量(Label-free):是一种非标记的差异蛋白质组学技术,不需要使用同位素标记物标记肽段,直接根据质谱峰的信号强度来对肽段或蛋白进行相对定量。Label-free通过HPLC分级液质联用对酶解肽段进行分析,现在基于质谱的非标定量技术主要有两种:一是根据一级质谱相关的肽段峰强度以及峰面积等信息进行蛋白定量,二是根据蛋白对应肽段的二级质谱总数(spectral counts)进行定量。

     


    实验步骤

    1. 蛋白前期处理,包括去除核酸,蛋白纯化定量,SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳;

    2. 蛋白质胶内酶切;

    3. 多肽纯化;

    4. 多肽混合物的质谱分析,包括质谱鉴定和定量信息比较;

    5. 生信分析

    iTRAQ&TMT

    同位素标记定量

    iTRAQ(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)&TMT(Tandem Mass Tags)分别由AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术,利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或者赖氨酸侧链基团,不同分子量的试剂对不同来源的样品进行标记从而实现不同样品间蛋白质组的比较。

     

    iTRAQ实验步骤

    1. 样品准备:将待测样品进行定量计算出样品蛋白浓度;

    2. 蛋白还原烷基化及酶解:每组样品各取100μg按照iTRAQ试剂盒要求进行处理,使用测序级胰蛋白酶溶液酶解后,超滤管离心收集酶解肽段;

    3. iTRAQ标记:将iTRAQ试剂平衡到室温,用150μL异丙醇溶解,取酶解肽段加入iTRAQ试剂后室温反应2 h,加入水终止反应,等量混合不同组样品,真空冷冻干燥样品;

    4. LC-MS-MS分析:使用Thermo的Q-Exactive Orbitrap进行串联质谱鉴定。

    5. 数据处理及生信分析


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