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  • 杰凯生物          科研服务
    详细内容

    功能实验

    细胞克隆

    软琼脂克隆

    克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状

     


    实验步骤

    1. 获取样本,培养细胞,

    2. 调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。

    3. 制备底层琼脂,完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1:9比例在 40℃ 均匀混合,加入培养皿(直径 60mm )中,每皿含0.5%琼脂培养基2ml,室温下琼脂完全凝固。

    4. 制备上层琼脂,37℃ 密度每皿含200个的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中,加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀,即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中,室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。

    5. 当培养皿中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS液小心浸洗2次,空气干燥。甲醇固定15分钟,弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟,流水缓慢洗去染液,空气干燥。



    细胞自噬

    自噬及其生物学功能

    细胞自噬(Autophagy)是真核生物中一种由溶酶体介导的高度保守的降解过程。在能量匮乏,活性氧累积等各种胁迫条件下时,细胞通过形成双层膜结构的自噬小体,包裹一部分胞内物质并将其运送到溶酶体进行降解和重新利用,从而维持细胞的存活。根据胞内底物运送到溶酶体的方式不同,哺乳动物细胞自噬可分为三种主要方式:巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy)。通常我们所研究的是巨自噬,简称自噬。



    自噬研究常规思路

    通常情况下,除了研究自噬现象本身,大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来,把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激,如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等,通常的研究模式:

    1. 证明自噬参与了相关研究表型(电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等)

    2. 证明自噬在表型中起到关键作用(通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究)

    3. 找到表型与自噬桥梁分子(检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员)

    4. 在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。


    自噬相关研究领域

    1.  自噬起始和终止的分子机制

    2. 细胞自噬与肿瘤

    3. 细胞自噬与免疫

    4. 自噬参与炎症信号通路的调节

    5. 细胞自噬与神经退行性疾病

    6. 激活自噬促进免疫化疗和放疗 

    7. 表观遗传学与细胞自噬的关系

    8. 药物治疗自噬.


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